Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова РАН
Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Лаборатория ПРОБЛЕМ РЕГЕНЕРАЦИИ

Направления исследований

Основным направлением исследований лаборатории является изучение механизмов регенерации и развития тканей у позвоночных животных (д.б.н. Григорян Э.Н.). У амфибий сетчатка глаза восстанавливается за счет репрограммирования клеток ретинального пигментного эпителия (рис. 1). Для расшифровки механизмов этого процесса в лаборатории используются различные модели повреждения сетчатки (удаление, отслойка, облучение ярким светом и т.д.) и широкий спектр методов, позволяющий оценить пролиферацию, апоптоз, превращения клеточного фенотипа, изменение экспрессии генов и регуляторных факторов на всех этапах регенерации сетчатки.


Рис. 1. Репрограммирование клеток РПЭ тритона Pl. waltl. при повреждении сетчатки ярким светом (полутонкие срезы, H-E).

Так, при регенерации сетчатки у тритона Pl. waltl. обнаружено дифференциальное (по локализации и времени) участие генов и белков теплового шока, а также компонентов Fgf2 сигнального пути (рис. 2). Недавно в тканях глаза того же вида обнаружена экспрессия гена и белка нуклеостемина (Ns), рибосомального регулятора и маркера низкого уровня дифференцировки (рис. 3). Этот факт наряду с другими, выявленными нами молекулярно-генетическими «ювенильными атрибутами» клеток и тканей глаза и мозга Urodela, позволяет дать объяснение успешной регенерации зрительной системы у этих животных (к.б.н. Маркитантова Ю.В.).


Рис. 2. Экспрессия гена fgf2 в тканях нативного глаза и в ходе регенерации по данным ПЦР. Справа длина продуктов ПЦР в парах нуклеотидов. 1- сетчатка, 2 – РПЭ, 3- регенерат сетчатки, 8-е сут; Б - Динамика экспрессии гена fgf2 на ранних стадиях регенерации сетчатки. 1- сетчатка, 0 сут, 2 – ретинальный пигментный эпителий (РПЭ), 0 сут, 3 – РПЭ, 4 сут; 4 – РПЭ, 8 сут.


Рис. 3. Результаты сравнения (гомология, %) нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей анализируемых участков гена и белка Ns. 1 – P. waltl, 2 – С. pyrrhogaster, 3 – N. Viridescens.

В условиях in vitro при использовании органотипического 3D культивирования изолированной сетчатки высших и низших позвоночных ведется поиск ранее не известных механизмов реконструкции сетчатки и источников ее регенерации, а также способов их активации. Методами молекулярной биологии и иммуногистохимии исследуется развивающаяся сетчатка глаза тритона Pl. waltl. В результате обнаружена общность молекулярных механизмов, работающих на этапе дифференцировки сетчатки при развитии и регенерации.

На протяжении многих лет проводится изучение особенностей регенерации у низших и высших позвоночных животных в условиях симулированных невесомости и гипергравитации, а также в реальных космических полетах (д.б.н. Григорян Э.Н.). В результате выдвинута гипотеза о существенном значении преадаптации к низким дозам g для успеха прохождения восстановительных процессов. Данные, полученные в ходе 30-дневного космического полета на биоспутнике Бион М1 (2013) в совместном эксперименте с ИМБП РАН и Эймским центром НАСА, демонстрируют снижение регенерационного потенциала мышц мышей в условиях невесомости (рис. 4). Григорян Э.Н., Блэйбер Е., Поплинская В.А., Радугина Е.А., Маркитантова Ю.В., Альмейда Е.А.М. Гипотрофия и угнетение регенерации мышц бедра у мышей. Сборник: Космический научный проект "Бион М1". Медико-биологические эксперименты и исследования / под редакцией А.И.Григорьева. - М.: ГНЦ РФ - ИМБП РАН, 2016. С. 254-265. ISBN 978-5-902119-32-6.



Рис. 4. Мышечная атрофия и угнетение тканевой регенерации в группе мышц Quadriceps у мышей, перенесших длительный космический полет на биоспутнике Бион М1. Они проявляются в значительном снижении числа миоядер (А), высоком уровне апоптоза (Б) по сравнению с контролем (В), атипичной форме и последубщей дегенерации регенерирующих мышечных волокон (Г) по сравнению с контролем (Д).

В последнее время нами разработана модель для изучения влияния гравитационной нагрузки на формообразование – изменение формы регенерирующего хвоста у тритонов при разных дозах g. В 2015 было обнаружено, что сходный с эффектом гравитационной нагрузки феномен воспроизводится при действии теплового шока. Фармакологическое ингибирование белков теплового шока, не оказывая существенного влияния на форму регенератов в нормальных условиях, предотвращает ее изменение в условиях измененной гравитационной нагрузки. Предполагается, что белки теплового шока могут быть задействованы в цепи событий, ведущих от восприятия неспецифического физического воздействия к изменению морфогенеза. Тот факт, что после теплового шока и в условиях измененной гравитационной нагрузки белки Hsp70 и Hsp90 появляются в нехарактерной локализации (в эпидермисе), согласуется с высказанной гипотезой. (Радугина Е.А., Григорян Э.Н. Морфогенетические изменения при регенерации хвоста у тритонов в условиях различной гравитационной нагрузки // Известия РАН. Серия биологическая. 2012. № 5. С. 478-485. Перевод - Radugina E.A., Grigoryan E.N. Morphogenetic changes during newt tail regeneration under changed gravity conditions // Biology Bulletin. 2012. V. 39. Issue 5. P. 402-408. DOI 10.1134/S1062359012040103.



Рис. 5. Роль белков теплового шока в изменении формы регенерирующего хвоста тритона под действием внешних факторов. Загиб хвоста при действии увеличенной гравитационной нагрузки (1g) и теплового шока (А) и его предотвращение введением ингибиторов теплового шока (Б). Нехарактерная для контролей эпидермальная локализация белков теплового шока - Hsp70 в хвосте после теплового шока (В), Hsp70 в загнутом регенерате при 1g (Г), Hsp90 в загнутом регенерате при 1 g (Д).

В раннем пренатальном развитии глаза человека в составе стекловидного тела глаза были обнаружены молекулы белков альбумина, α-фетопротеина и каротиноида лютеина, которые играют важную морфогенетическую роль. Для исследования сывороточных альбуминов были разработаны специфические красители-зонды, с помощью которых был определен уровень сывороточного альбумина в стекловидном теле в зависимости от действия ряда фармпрепаратов при увеитах на животных моделях (рук. д.б.н. И.Г.Панова).

На модели развития хрусталика мыши осуществлен тканеспецифический нокаут бета 1-интегрина на стадии формирования первичных волокон (к.б.н. Симирский В.Н.). Нокаут приводил к изменениям сигнальных путей TGFbeta и BMP, увеличению экспрессии αV-интегрина и эпителио-мезенхимному переходу в эпителии хрусталика (Рис. 6). Предполагается, что β1-интегрин обеспечивает нормальный морфогенез эпителия хрусталика, тогда как αV-интегрин инициирует эпителио-мезенхимный переход.


Рис. 6. Повышение уровня гладкомышечного a-актина в эпителии хрусталика мыши после нокаута α1-интегрина на стадии формирования первичных волокон. Э -эпителий хрусталика; В – волокна хрусталика

Благодаря усилиям профессора О.Г. Строевой удалось разработать, научно обосновать, запатентовать и внедрить в практику лекарственное средство «АКТИПОЛ®» - глазные капли (0,007% раствор пара-аминобензойной кислоты). «АКТИПОЛ®» является регулятором ферментативной активности, индуктором интерферона и регулятором продукции Ил-6. В настоящее время в лаборатории изучаются новые лечебные свойства препарата и ведется его внедрение за рубежом.


ГРИГОРЯН
Элеонора Норайровна

доктор биологических наук,
возглавляет лабораторию.
e.mail: leonore@mail.ru
  • Строева Ольга Георгиевна,
    г.н.с., д.б.н., профессор
  • Панова Ина Георгиевна,
    в.н.с., д.б.н.
  • Маркитантова Юлия Владимировна,
    с.н.с., к.б.н.
  • Симирский Владимир Николаевич,
    с.н.с., к.б.н.
  • Авдонин Петр Павлович,
    н.с., к.б.н.
  • Новикова Юлия Петровна,
    н.с., к.б.н.
  • Поплинская
    Валентина Антониновна,
    н.с., к.б.н.
  • Радугина Елена Александровна,
    ст. лаб, к.б.н.

Группа экспериментальной нейробиологии
  • АЛЕКСАНДРОВНА
    Мария Анатольевна
    г.н.с.,
    д.б.н.
  • Кузнецова Алла Викторовна,
    с.н.с., к.м.н.
  • Подгорный Олег Владимирович,
    с.н.с., к.б.н.
  • Куринов Александр Михайлович,
    нс
  • Малахова Елена Валерьевна,
    ст. лаб
  • Ржанова Любовь Александровна,
    ст. лаб.
  • Сухинич Кирилл Константинович,
    м.н.с.

Группа молекулярно-генетических механизмов онтогенеза
  • МИКАЭЛЯН Арсен Суренович,
    с.н.с., к.б.н.
  • Зиновьева Рина Дмитриевна,
    г.н.с., д.б.н., профессор
  • Дашенкова Наталия Олеговна,
    ст. лаб.
  • Смирнова Юлия Анатольевна,
    н.с., к.б.н.
  • Зиневич Людмила Сергеевна,
    м.н.с.

Группа эмбриофизиологии
  • ШМУКЛЕР Юрий Борисович,
    в.н.с., д.б.н.
  • Никишин Денис Александрович,
    н.с., к.б.н.
  • Звездина Наталья Давыдовна,
    с.н.с., к.б.н.
  • Мальченко
    Людмила Александровна,
    м.н.с.


Исследования группы экспериментальной нейробиологии (д.б.н. Александрова М.А.) направлены на изучение нейральных стволовых клеток животных и человека и их участия в регенерации. В результате изучения дифференцировки клеток и развития связей в разных моделях трансплантации неокортекса, взятого от эмбрионов GFP-мышей, обнаружено, что после периода адаптации, развитие и дифференцировка клеток, перенесенных в составе тканевых трансплантатов, значительно опережает развитие тех же клеток в составе инъецированных суспензий. На модели культивированных и претерпевающих конверсию фенотипа in vitro клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого человека обнаружено, что они обладают свойствами стволовых клеток и способны к нейральной и эпителиальной дифференцировкам (рис.7). Выяснено, что в механизмах изменения характера дифференцировки участвует Wnt-сигнальный путь, его лиганд Wnt7a оказывает плейотропное воздействие на дедифференцированные in vitro клетки РПЭ за счет модуляции Notch- и BMP-сигнальных путей.


Рис. 7. Экспрессия маркерных белков в дедифференцированных клетках ретинального пигментного эпителия человека, культивированных in vitro.

В настоящее время считается, что постнатальный нейрогенез в зубчатой извилине гиппокампа млекопитающих необходим для процессов обучения и памяти. Начало новым нейронам гранулярного слоя дают так называемые покоящиеся клетки-предшественники субгранулярного слоя, обладающие признаками клеток радиальной глии. За последнее десятилетие накопилось достаточно много данных о связи между ухудшением когнитивных способностей, возникновением депрессии и снижением нейрогенеза, вызванным естественным старением или клиническими манипуляциями, такими как противораковая терапия и общая анестезия. В своей работе мы изучаем клеточные механизмы и кинетику рождения новых нейронов для того, чтобы, с одной стороны, понять в деталях, как происходит нейрогенез, а с другой - научиться анализировать нарушения в каскаде продукции новых нейронов в результате негативных воздействий. Нами разработан ряд новых подходов к количественному анализу пролиферативного каскада на основе множественного мечения производными тимидина. (к.б.н. О.В. Подгорный).





АЛЕКСАНДРОВНА
Мария Анатольевна
,
г.н.с.,
доктор биологических наук.
Руководитель Группы кспериментальной нейробиологии.
e.mail: mariaaleks@inbox.ru


В группе молекулярно-генетических основ онтогенеза изучается экспрессия транскрипционных факторов, участвующих в морфогенезе глаза позвоночных, в том числе человека (д.б.н. Зиновьева Р.Д.). Проводится пространственно-временная характеристика экспрессии транскрипционных факторов семейства Vsx, Vsx1и Vsx2, в формирующейся сетчатке глаза эмбрионов кур (рис. 8А). Экспрессия генов-маркеров плюрипотентного статуса ЭСК: NANOG, OCT4B, OCT4-PG1/POU5F1B, GNL3 обнаружена как в пролиферирующих клетках, способных к самообновлению, так и в дифференцированных клетках глаза взрослого человека (рис. 8Б).

A Б
Рис.8. ПЦР-анализ: А. - Vsx1/Chx10-1, Vsx2/Chx10, Pax6, Prox1, Rho и Gapdh в ходе развития сетчатки кур, в сутках; Б. - NANOG, OCT4, OCT4В, POU5FB и RPL19 в тканях глаза взрослого человека.

На модели гепатокарциномы мыши и ее клеточных линий, изучается экспрессия генов-участников Igf-1 сигнального пути, Igf-1, Igf-1R, Igfbp-1, Igfbp-2, Igfbp-3, Igfbp-5, и некоторых генов, играющих важную роль в клеточной адгезии и миграции, Cdh1, Cdh2, Ctnnb1, CD44 (кбн Микаелян А.С.) (рис. 9).



Рис. 9. Кластерный анализ данных, полученных методом ПЦР в реальном времени по экспрессии исследуемых генов.



Сотрудники лаборатории проблем регенерации, 2016 год.
Слева направо, верний ряд: Симирский Владимир Николаевич, Кузнецова Алла Викторовна, Маркитантова Юлия Владимировна, Сухинич Кирилл Константинович, Александрова Мария Анатольевна, Куринов Александр Михайлович, Дашенкова Наталия Олеговна, Авдонин Петр Павлович, Новикова Юлия Петровна, Микаелян Арсен Суренович.
Нижний ряд: Строева Ольга Георгиевна, Григорян Элеонора Норайровна, Поплинская Валентина Антониновна, Панова Ина Георгиевна, Зиновьева Рина Дмитриевна.




МИКАЭЛЯН
Арсен Суренович
, с.н.с.,
кандидат биологических наук.
Руководитель Группы.
e.mail: arsmikael@gmail.com


Работы сотрудников Группы эмбриофизиологии (руководитель - д.б.н. Шмуклер Ю.Б.) традиционно посвящены изучению несинаптических функций классических нейромедиаторов. Современные знания об этом до сих пор определяются достижениями Бузникова Г.А., основателя этого направления не только в отечественной, но и в мировой науке.

Геннадий Алексеевич Бузников

Геннадий Алексеевич Бузников
(18.01.1931 - 27.08.2012)

Установлено, что такие нейромедиаторы как серотонин, катехоламины и ацетилхолин участвуют в регуляции ключевых событий эмбриогенеза: запуск клеточного цикла делений дробления, межбластомерные взаимодействия, морфогенез. Причем сразу несколько нейромедиаторов могут быть функционально активны в пределах одной зародышевой клетки задолго до формирования нервной системы. До последнего времени почти полностью отсутствовали исследования на молекулярном уровне. В 2009-2014 г. в лаборатории впервые был проведен исчерпывающий анализ экспрессии в эмбриогенезе основных компонентов серотонинергической системы у трех различных филогенетических групп: иглокожих (Paracentrotus lividus), амфибий (Xenopus laevis) и млекопитающих (мышь). В раннем эмбриогенезе всех исследованных объектов выявлена 1) экспрессия мРНК ферментов синтеза серотонина, причем триптофангидроксилаза представлена ее нейральной формой; 2) экспрессия мембранного транспортера серотонина SERT, функция которого состоит в обратном захвате серотонина из внеклеточной среды в цитоплазму. В эмбриогенезе мыши и шпорцевой лягушки также обнаружена экспрессия гена везикулярного транспортера моноаминов, участвующего в дефинитивных клетках в аккумулировании серотонина в везикулах и межклеточной сигнализации, в виде характерной для нервной системы формы (Рис. 10). Одновременная экспрессия уже на самых ранних стадиях развития нескольких генов, кодирующих серотониновые рецепторы - ключевое звено процесса, оказалась неожиданным, но объяснимым фактом. Это связано с многофункциональностью серотонина на ранних стадиях. В зародышах шпорцевой лягушки выявлена экспрессия серотониновых рецепторов подтипов 1Е, 2С и 5, а у мыши – 1А, 1F, 2А, 5А, 5В и 7. Существенно, что у мыши и лягушки одновременно экспрессируются рецепторы с противоположным действием на систему вторичных мессенджеров (в данном случае – аденилатциклазную). Можно предположить, что таким образом организована серотониновая сигнализации в клетках зародышей в пространстве и времени, а также первичная межбластомерная сигнализация.

Изучение несинаптических функций нейромедиаторов у взрослых организмов на модели регуляции ритма синтеза белка в клетках печени млекопитающих показало, что синхронизация ритма специфически регулируется различными медиаторами: она усиливается при действии серотонина и наномолярных концентраций мелатонина, а дофамин десинхронизирует ритм синтеза белка в культуре гепатоцитов крысы.


Рис. 10. Экспрессия различных типов серотониновых рецепторов в онтогенезе Xenopus laevis.




ШМУКЛЕР
Юрий Борисович
, в.н.с.,
доктор биологических наук.
Руководитель Группы.
e.mail: ybs@hotbox.ru