Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова РАН
Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Лаборатория КЛЕТОЧНЫХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ГИСТОГЕНЕЗА

Направления исследований

В настоящее время в объединенной лаборатории клеточных и молекулярных основ гистогенеза проводятся исследования по нескольким направлениям, включающим изучение механизмов клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий, а также закономерностей формирования и функционирования тканевых систем в индивидуальном развитии. Особое внимание уделяется изучению эмбриональных и тканеспецифических стволовых клеток, обеспечивающих формирование организма, а также физиологическую и репаративную регенерацию его тканей и органов.

1. Гистогенез тканей внутренней среды: роль стволовых мезенхимных клеток. Стволовые мезенхимные клетки (МСК) в индивидуальном развитии.


Впервые проведено сравнительное исследование фенотипических особенностей и потенций к дифференцировке пре- и постнатальных генераций МСК (рис. 1). Полученные экспериментальные данные показали, что в ходе индивидуального развития происходит функциональное созревание МСК. На основании выявленных различий в свойствах МСК в зависимости от их локализации и стадии онтогенеза предложена концепция развития организуемой ими кроветворной ниши. В процессе развития МСК приобретают компетентность к дифференцировке в специфические клеточные компоненты ниши, вследствие чего меняется качество кроветворного микроокружения (рис. 2). Это приводит к формированию популяции дефинитивных стволовых кроветворных клеток, способствуя их переходу от активного размножения в печени зародыша к состоянию покоя и самоподдержания в зрелом костном мозге.

В лаборатории проводятся также исследования спонтанного миогенеза в немышечных органах, которые показали присутствие предшественников скелетно-мышечной дифференцировки в пренатальном развитии в печени, селезенке, кишечнике, тимусе.


Рис. 1. Источники и функции мезенхимных стромальных клеток


Рис. 2. Мезенхимные стромальные клетки и развитие кроветворной ниши в онтогенезе

Рис. 3. CD90 в МСК из печени 14-суточных зародышей крысы


Рис. 4. Эпителиальная колония в первичной культуре клеток зародышевой печени крысы. Иммуноцитохимическое окрашивание на панцитокератин



Рис. 5. Дифференцировка МСК костного мозга крысы в индукционных средах:

а – остеогенез, б – адипогенез


Рис. 6. Хондрогенез в эктопическом трансплантате печени 16-суточного зародыша крысы

Рис. 7. Спонтанный миогенез в культуре зародышевой печени крысы:

а – окрашивание азур-эозином,

б – иммуноцитохимическое окрашивание на Myf-5


Не исключено, что существование миогенных предшественников в неорганотипической локаликации возможно благодаря МСК, которые создают для них соответствующее микроокружение. Исследована способность МСК участвовать миогенезе и показано, что МСК в условиях in vitro усиливают миогенную активность мышечных клеток посредством паракринного влияния, обладая, однако, слабыми миогенными потенциями и способностью участвовать в формировании миотуб путем слияния.

В настоящее время начаты исследования участия МСК в регенерации на моделях восстановления мышечной ткани после повреждения. Уникальные свойства МСК (способность к регуляции многих клеточных функций путем паракринного влияния) и их способность участвовать в регуляции репаративного процесса на всех его стадиях – воспаления, пролиферации и ремоделирования позволяют рассматривать их как инструмент тканевой инженерии in vivo, стимулирующий регенерацию тканей за счет внутренних резервов. В этой связи весьма перспективны исследования участия МСК в регенерации на разнообразных экспериментальных моделях, активации их паракринной функции и повышения эффективности доставки МСК и кондиционированной ими среды в область повреждения.

Коллектив:
  • ДОМАРАЦКАЯ Елена Ивановна,
    д.б.н., зав. лаб.
  • БРОДСКИЙ Всеволод Яковлевич
    г.н.с. д.б.н. профессор
  • ЗАХАРОВА Людмила Алексеевна
    г.н.с. д.б.н. профессор
  • УРЫВАЕВА Ирина Васильевна
    г.н.с. д.б.н.
  • МАКАРЕНКО Ирина Георгиевна
    в.н.с. к.б.н.
  • ПАЮШИНА Ольга Викторовна
    с.н.с. д.б.н.
  • ГОРДЕЕВА Ольга Федоровна
    с.н.с. д.б.н.
  • МЕЛЬНИКОВА Виктория Ильинична
    с.н.с. к.б.н.
  • БУТОРИНА Нина Николаевна
    с.н.с. к.б.н.
  • ИЗВОЛЬСКАЯ Марина Сергеевна
    н.с. к.б.н.
  • ШЕВЕЛЕВА Ольга Николаевна
    н.с. к.б.н.
  • ВОРОНОВА Светлана Николаевна
    н.с. к.б.н.
  • ТОРТУНОВА Татьяна Алексеевна
    ст.лаб..
  • ЛИФАНЦЕВА Надежда Валерьевна
    ст. лаб.
  • МАЙОРОВА Татьяна Дмитриевна
    ст. лаб.
  • ШАРОВА Виктория Сергеевна
    ст. лаб.
  • РАМАЗАНОВА Сабина Гамзатовна
    асп.



Елена Ивановна Домарацкая

Заведующий лабораторией, д.б.н.
Тел. 8-499-135-87-80
edomar@mail.ru




Ольга Викторовна Паюшина
старший научный сотрудник,
доктор биологических наук.
payushina@mail.ru




Нина Николаевна Буторина
старший научный сотрудник,
кандидат биологических наук.
nnbut@mail.ru




Ольга Николаевна Шевелева
научный сотрудник,
кандидат биологических наук.
on_sheveleva@mail.ru




Татьяна Алексеевна Тортунова
старший лаборант.
edomar@mail.ru




Сабина Гамзатовна Рамазанова
аспирант.
edomar@mail.ru


2. Прямые межклеточные взаимодействия в онтогенезе (В.Я. Бродский)


Под руководством профессора В.Я. Бродского в совместных работах с группой эмбриофизиологии (лаб. проблем регенерации) выявлен механизм прямых межклеточных взаимодействий. В исследованиях клеточных культур и in vivo в экспериментах на крысах определены сигнальные факторы и цепь процессов в цитоплазме, приводящих к кооперации клеток в ритмах разных функций. Обнаружены нарушения кооперации клеток соответственно с изменениями межклеточной среды при старении и получены первые данные о возможности компенсации изменений.

На оригинальной модели на примерах кинетики синтеза белка в печени и в популяции кератиноцитов кожи в опытах in vitro и in vivo показана значимость прямых межклеточных взаимодействий в регуляции активности органа. Впервые выявлены сигнальные факторы кооперации клеток как положительные, организующие активность клеток, так и отрицательные, дезорганизующие клеточную популяцию; среди них катехоламины – серотонин, норадреналин, дофамин, их фармакологические производные, а также мелатонин и ганглиозиды. В качестве ключевого фактора организации клеточных популяций рассматривается фосфорилирование белков, что объясняет некоторые стороны действия используемых в клинике мелатонина, фенилэфрина, дофамина и открывает перспективу поиска лекарств-организаторов.






Всеволод Яковлевич Бродский
главный научный сотрудник,
доктор биологических наук, профессор.
Тел. 8-499-135-70-09
brodsky.idb@bk.ru

3. Исследование развития проводящих систем мозга (И.Г. Макаренко)


С помощью метода транспорта карбоцианиновых красителей исследованы наиболее ранние эмбриональные стадии развития аксональных связей мозга. Полученные результаты являются уникальными и не имеют аналогов в мировой литературе. Обобщены данные по развитию трактов мамиллярных тел (мамиллотегментального, мамиллярной ножки и мамиллоталамического). Полученные факты дают представление о фундаментальных процессах и сроках формирования связей между различными отделами мозга.


Рис. 8. A, B: тракты мамиллярных тел (МВ) на сагиттальных срезах плода крысы (Е 19) выявленные с помощью DiI на 19 день пренатального развития (mth – мамиллоталамический; mtg – мамиллотегментальный).
С: конфокальные изображения растущего конца мамиллоталамического тракта, многочисленные волокна которого имеют конусы роста, представленные с большим увеличением на рисунках D и E. Масштаб 200 μm для A, 80 μm для В; 20 μm для С и 8 μm для D и E.


Рис. 9.
Конфокальное изображение терминальных ветвлений аксонов мамиллоталамического тракта в антеровентральном ядре таламуса на 10 день постнатального развития.

Рис. 10.
Отдельная терминальная кисточка на периферии антеровентрального ядра таламуса




Ирина Георгиевна Макаренко
ведущий научный сотрудник,
кандидат биологических наук.
Тел. 8-499-135-70-09
imakarenk@mail.ru

4. Исследование молекулярно-генетических механизмов поддержания плюрипотентного статуса эмбриональных стволовых клеток млекопитающих и человека (Гордеева О.Ф.)


На основании исследований линий нормальных плюрипотентных стволовых и малигнизированных тератокарциномных клеток мыши сформулирована концепция о ключевых факторах, которые регулируют различные фазы плюрипотентного статуса. Впервые показано, что базовый (ground state) и первичный (primed state) статус плюрипотентности клеток млекопитающих ассоциирован с паттернами экспрессии генов, специфических для линии половых клеток. Обнаружены различия в специфических профилях раково-тестикулярных антигенов в нормальных плюрипотентных и опухолевых клетках, которые позволяют выявить трансформированные клетки в культивируемых популяциях in vitro.

Впервые показано, что механизмы сигнальной регуляции самообновления и дифференцировки клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности значительно различаются вследствие различий в уровнях эндогенной экспрессии генов, кодирующих факторы TGFβ1, BMP4, FGF2, а также ActivinA.

Анализ динамики роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши и человека in vivo после трансплантации иммунодефицитным и иммунокомпетентным животным-реципиентам позволил определить ключевые параметры, влияющие на формирование экспериментальных опухолей. Эти данные могут быть применены для разработки новых эффективных методов лечения тератокарцином и стандартизованных методов тестирования онкогенного потенциала производных плюрипотентных стволовых клеток.

На основе комплексных исследований роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в 3D-системах in vitro установлены факторы, влияющие на динамику дифференцировки и морфогенеза эмбриоидных тел и их устойчивость к повреждающим факторам, что позволяет использовать разработанные модели ранних стадий развития млекопитающих для оценки эмбриотоксичности.


Ольга Федоровна Гордеева
старший научный сотрудник,
доктор биологических наук.
Тел. 8-499-135-87-80
olgagordeeva@yandex.ru


5. Клеточный цикл гепатоцитов при регенерации печени (И.В. Урываева)


Исследования последних нескольких лет продолжают традиции изучения клеточного цикла в связи с особенностями метаболизма разных тканей при пролиферации дифференцированных функционирующих клеток. Активными участниками исследований проблемы взаимоотношений специальных функций и клеточного цикла, а также развития полиплоидии в печени, клетках пигментного эпителия сетчатки, миоцитах сердца были сотрудники лаборатории цитологии В.М. Фактор, Т.Л. Маршак, А.М. Арефьева, Г.В. Делоне.

Современный уровень изучения индуцированной пролиферации определяется открытием у человека и позвоночных нового класса генов, контролирующих в клеточном цикле переход G0/G1. В первом после выхода из состояния покоя периоде G1 происходит переключение путей выработки энергии. Экспрессия гена G0S2, контролирующего переход G0/G1, выявлена в метаболически активных тканях - в жировой, печени - и в гематопоетических клетках.

В проводимых сейчас исследованиях было обнаружено, что в гепатоцитах регенерирующей печени белок Ki67, универсальный маркер клеточного цикла, не экспрессируется в G1-периоде первого индуцированного цикла (переход G0/G1), но выявляется затем в повторных митотических циклах (переход M/G1). Предполагается, что ограничения экспрессии белка Ki67 в первой после индукции G1-фазе связаны с резкой перестройкой на этом этапе регенерации метаболизма пролиферирующих гепатоцитов.





Ирина Васильевна Урываева
главный научный сотрудник,
доктор биологических наук.
Тел. 8-499-135-70-09
uryvaeva39@mail.ru

6. Становление иммунной системы в онтогенезе: роль протеасом, нейро- и иммуномедиаторов. Взаиморегуляция развития нервной и иммунной систем


Основным научным направлением исследований является изучение клеточных и молекулярных механизмов регуляции развития иммунной и репродуктивной систем млекопитающих в норме и при патологических состояниях. Совместно с лабораторией биохимии процессов онтогенеза (ранее лаб. биохимии) и сотрудниками института цитологии и генетики СО РАН были исследованы роль протеасом и нейропептида аргинин-вазопрессина (АВП) в развитии иммунной системы и противоопухолевом иммунитете. Получены новые оригинальные данные об участии иммунных протеасом в становлении процессов селекции и дифференцировки Т-лимфоцитов в тимусе крыс уже в перинатальном онтогенезе


Рис. 11. Увеличение содержания иммунных протеасом (субъединиц LMP7 и LMP2) в эмбриональном тимусе. (Мельникова с соавт., 2008; Melnikova et al., 2009).

Исследования особенностей иммунной системы в условиях дефицита циркулирующего АВП у мутантных крыс линии Brattleboro показали, что у них наблюдаются ранняя инволюция тимуса и селезенки, снижение численности лимфоцитов в крови, нарушения в развитии клеточного и гуморального иммунитета (Хегай с соавт., 2003; Захарова, 2010). В то же время у крыс этой линии ярко выражен противоопухолевый иммунитет. Имплантация карциносаркомы Walker 25 или гепатомы Зайделя крысам Brattleboro приводит к снижению роста опухолей и полной их регрессии через месяц после имплантации. Регрессия опухолей сопровождается увеличением экспрессии иммунных протеасом, антигенов ГКГ класса I и численности субпопуляций Т-лимфоцитов в селезенке


Рис. 12.
Влияние дефицита аргинин-вазопрессина (АВП) на противоопухолевый иммунитет.

Это приводит к повышению иммуногенности опухолей и их уничтожению системой адаптивного иммунитета (Zakharova et al., 2011; Мельникова с соавт., 2014).

Получены новые данные о молекулярных механизмах и клеточных основах формирования и функционирования иммунной системы млекопитающих. Показан высокий уровень экспрессии рецепторов к нейрогормонам - гонадотропин-рилизинг гормону (ГРГ) и серотонину в тимусе плодов на 17-й день эмбрионального развития. Блокада рецепторов селективными антагонистами в период наиболее их высокой экспрессии приводит к нарушениям в развитии Т-системы иммунитета в тимусе плодов и изменениям в функционировании Т-лимфоцитов у половозрелого потомства крыс


Рис. 13. Возрастная динамика экспрессии рецепторов ГРГ в развивающемся тимусе крыс и их функциональная активность. (Мельникова с соавт., 2012, 2015).

При введении антагонистов половозрелым особям изменения в развитии иммунного ответа либо не наблюдаются, либо кратковременные. ГРГ включается в регуляцию Т-клеточного иммунитета уже в пренатальном онтогенезе (Zakharova et al., 2000). Достаточно высокие концентрации ГРГ, сопоставимые с его содержанием в гипоталамусе, обнаружены в тимусе и периферической крови плодов крыс, тогда как в крови половозрелых особей он практически отсутствует (Zakharova et al., 2005). По-видимому, ГРГ может контролировать становление и функционирование иммунной системы как через гипоталамо-гипофизарную систему, так и осуществлять аутокринную или паракринную регуляцию. Совокупность полученных данных свидетельствует, что в эмбриональном развитии ГРГ и серотонин контролируют развитие тимуса, а экспрессия рецепторов к этим сигнальным молекулам на тимоцитах плодов предполагает возможность их непосредственного влияния на эти клетки.

Иммунная система, в свою очередь, оказывает влияние на развитие ГРГ-продуцирующей системы, как в норме, так и при воспалительных процессах, вызванных вирусной или бактериальной инфекцией (Zakharova, Izvolskaia, 2012). Нами была разработана модель пренатального инфицирования крыс и мышей эндотоксином грамотрицательных бактерий липополисахаридом (ЛПС). ЛПС, введенный на ранних сроках беременности, подавляет начальные этапы дифференцировки ГРГ нейронов и их миграцию из назальной области в мозг у плодов крыс и мышей, и как следствие, нарушается становление репродуктивной системы (Шарова с соавт., 2011). Активация иммунной системы матери ЛПС вызывает как у матери, так и плодов повышенную экспрессию провоспалительных цитокинов, интерлейкина 6, лейкемия ингибирующего фактора и белка хемотаксиса моноцитов, подавляющих интраназальную миграцию ГРГ-нейронов в мозг. У интактных животных по ходу миграции нейронов в мозг выявлены рецепторы к этим цитокинам и периферину также выстилающему путь миграции нейронов


Рис. 14. Рецепторы к ИЛ-6 и ЛИФ в регуляции миграции ГРГ нейронов на ранних сроках развития у плодов мышей. (Sharova et al., 2015).

Появление ГРГ-нейронов в переднем мозге с опозданием может изменять формирование необходимых аксональных связей в гипоталамусе, что приводит к нарушениям в функционировании гипоталамо-гипофизарно-репродуктивной системы и подавлению репродуктивной способности самцов и самок (Izvolskaia et al., 2016). Таким образом, иммунная и нейроэндокринная системы способны эффективно осуществлять взаиморегуляцию различными сигнальными молекулами и их рецепторами уже на начальных этапах своего развития.


Рис. 15. Взаимные регуляторные влияния нейроэндокринной и иммунной систем в онтогенезе млекопитающих.



Людмила Алексеевна Захарова
(Liudmila A. Zakharova),
главный научный сотрудник, доктор биологических наук, профессор.
Тел. 8-499-135-87-80
zakharova-l@mail.ru




Виктория Ильинична Мельникова
(Victoria I.Melnikova)
старший научный сотрудник, кандидат биологических наук.
v_melnikova@mail.ru




Марина Сергеевна Извольская
(Marina S. Izvolskaya)
научный сотрудник.
izvolskaya@hotmail.com




Светлана Николаевна Воронова
(Svetlana N. Voronova)
научный сотрудник.
svetvor@mail.ru




Надежда Валерьевна Лифанцева
(Nadezhda V. Lifanceva)
старший лаборант
lifanceva@yandex.ru




Виктория Сергеевна Шарова
(Victoria S. Sharova)
старший лаборант
sarovav@mail.ru